¿Cómo medir los cambios celulares cuando realizamos un experimento?

Dependiendo de la pregunta que necesitamos hacer a nuestro modelo, medimos variables de distintos aspectos celulares que nos informan cambios en la viabilidad celular, la expresión génica, metabolitos o interacciones moleculares. Para cada una de estas variables, utilizamos kits y equipos especializados que hay que estandarizar. Sin embargo, que mejor que tener un sistema integral para medir todos estos cambios celulares partiendo de la misma base con tecnología sensible y confiable.

Para ello, Promega ha desarrollado el sistema Glomax que te permite medir esos cambios celulares utilizando un mismo equipo con una serie de productos basados en el mismo fundamento: Luminiscencia.

¿Qué es la luminiscencia?

Es aquella luz que observamos proveniente de organismos como las luciérnagas, hongos y algunas medusas, y bacterias. Esta luz es producto de una reacción química catalizada por una enzima llamada luciferasa que utiliza luciferina, ATP y oxígeno como sustratos. Durante la reacción, la luciferina pasa a un estado químico más energético y después, el compuesto experimenta una relajación vibracional hacia un estado de menor energía. La relajación final hasta el estado básico de la oxiluciferina libera energía en forma de luz.

Promega ha optimizado el gen de la luciferasa que de lugar a una proteína más estable y potente para monitorearse y cuantificarse en células y que a la vez responda rápidamente a la dinámica celular. De esta manera, es posible realizar ensayos utilizando la luciferasa como gen reportero en donde, el gen que codifica la luciferasa se pone bajo el control de las secuencias reguladoras de un gen de interés. Cuando se añade a la célula un reactivo que contiene luciferina y ATP, la cantidad de luz producida será proporcional a la cantidad de luciferasa expresada. Una mayor expresión génica se traduce en una mayor expresión de luciferasa y señal luminiscente y viceversa. Aún más importante, es que la señal luminiscente resultante de la reacción puede acoplarse a cualquiera de los otros reactivos de la reacción y no solo a la enzima. Otros ensayos pueden medir la cantidad o los cambios en la concentración de ATP o la liberación enzimática de luciferina u otros sustratos luminiscentes (Figura 1).

 
Figura 1. Tipos de ensayos basados en el componente de la reacción de luminiscencia.

Los ensayos de Promega se caracterizan por ser sensibles, simples y escalables.

Son ensayos SENCILLOS ya que la tecnología de los ensayos los hace termoestables por horas, de esta manera es factible que consistan en protocolos "añadir-mezclar-medir" y obtener resultados en menor tiempo.

Son ensayos con lecturas SENSIBLES que pueden detectar la actividad de un pequeño número de células y, al basarse en la luminiscencia, sus mediciones no son susceptibles a interferencias de fluorescencia de compuestos.

Tienen un enfoque ESCALABLE para aumentar los esfuerzos de alto rendimiento utilizando menos células, medios y tratamientos al tiempo que se realizan más ensayos en formatos de placas de pozos múltiples.

Incorporan otras señales que, aunado a las características antes mencionadas, hacen posible que los ensayos puedan medirse en tiempo real y realizar la medición de múltiples variables simultáneamente.

Ensayos Multiplex y en Tiempo Real

Es gracias a esta reacción que se han podido desarrollar una amplia gama de ensayos celulares que además de la luminiscencia incorporan otras señales como fluorescencia, absorbancia, BRET y FRET para medir más de una variable a la vez en Ensayos Multiplex (G6320) y en Tiempo Real (G9711).

Cultivo 3D

Finalmente, nos encontramos en la transición del cultivo en monocapa al cultivo en 3D debido a que se ha comprobado que el ambiente celular se replica de mejor manera de esta forma. Promega no se ha quedado atrás y ya cuenta con ensayos optimizados para cultivo en 3D (G9681). 

¿Qué podemos medir con los ensayos de luminiscencia?

La reacción de la luminiscencia se ha modificado y optimizado con ingeniería genética para la medición de múltiples procesos celulares, proporcional a la luminiscencia que se emite. Por ejemplo, los primeros ensayos de luminiscencia consisten en  genes reporteros como el Sistema Reportero Dual de Luciferasa (Luciferasa + Renilla) (E1910), el cual es dependiente  de la producción de la enzima luciferasa bajo el control de un gen o promotor específico. Posteriormente, al desarrollar una luciferasa recombinante, fue posible que la enzima tenga mayor termoestabilidad, facilitando ensayos añadir y medir en un solo paso: Ultra-Glo y One-Glo (E6110). Por ejemplo; los ensayos dependientes del ATP, los cuales miden el ATP disponible para medir células metabólicamente activas. Más tarde, se desarrollaron los ensayos dependientes del sustrato; la luciferina. Tal es el caso de los ensayos para medir metabolitos, que a partir de la adición de un pro- sustrato, una reductasa y la enzima metabólica, se genera la reacción de luminiscencia y la luz emitida es proporcional a la reacción del metabolismo que estamos midiendo.

Actualmente, Promega cuenta con una gama amplia de ensayos que permite realizar ensayos para medir: Viabilidad celular (G9241), citotoxicidad (J2380), apoptosis (G8981), necrosis, autofagia (GA2550), metabolitos (J6021), estrés  oxidativo (G8000), ADME (V9001) (Adsorción, distribución, metabolismo y excreción de fármacos), inflamación (JA2201) y genes reporteros.

En la tabla 1, se pueden observar algunos ejemplos pero la variedad es mucho mayor y se pueden consultar en: https://worldwide.promega.com/resources/technologies/luminescence-resource-center/

Tabla 1. Ejemplos de ensayos celulares Glomax basados en luminiscencia.